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【分享】NK细胞,肿瘤免疫治疗的新方向

发布时间:2021-04-12

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01
?肿瘤细胞正在“胜利大逃亡”


去年备受关注的诺贝尔生理学或医学奖,让“免疫负调控”的发现者詹姆斯·艾利森和本庶佑声名显赫。“免疫负调控”发生在抗原呈递期间,即初始T细胞与抗原呈递细胞之间传递抗原信号,以及细胞识别期间,即效应T细胞迁移进入肿瘤组织,与肿瘤细胞或免疫细胞之间传递识别信号期间。

大部分肿瘤细胞就是充分利用“免疫负调控”,来抑制细胞毒性T细胞的免疫活性,从而逃避免疫系统的追杀。具体地说,在正常状态下,当炎症反应发生时,NK细胞、T细胞、巨噬细胞、树突状细胞等免疫细胞,以及表皮细胞和血管内皮细胞表面会被诱导表达PD-L1蛋白。当这些细胞和被激活的T细胞接触时,PD-L1与T细胞表面的PD-1结合,从而抑制T细胞的免疫活性,避免过激的炎症反应对自身的伤害。因为这些细胞表面表达的PD-L1程度比较低,所以可以避免对T细胞活性的消耗。然而肿瘤细胞大不一样,它们在细胞表面大量表达PD-L1,能够几乎完全抑制与它们接触的所有T细胞的免疫活性,造成T细胞活性耗竭,并逃避免疫系统的追杀,最终恶性繁殖扩增,危及生命。(图1)


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图1 :免疫负调控示意图

(a)当T细胞对抗原产生初次响应时,CTLA-4介导的免疫检查点被诱导激活。这种由CTLA-4介导的诱导激活程度,依赖于起始T细胞受体调整的信号强度。高亲和配体能够诱导表达更多的CTLA-4,从而减弱了起始响应的强度。当T细胞受体遭遇抗原后,诱导下游通路,CTLA-4被转运到细胞表面,此时CTLA-4起到信号减弱的功能,以维持一个恒定的T细胞激活水平。(b)与CTLA-4不同,PD-1信号通路并不在起始T细胞激活阶段起作用,而是在外周组织中,效应T细胞识别组织中的抗原,以调节炎症响应的过程中。这些组织中的炎症信号(IFN-γ,主要由I型辅助T细胞表达)能够诱导组织细胞中的PD-L1的表达,从而抑制效应T细胞对其免疫响应。在慢性抗原暴露的情况下,T细胞表面过量诱导的PD-1,可以引发T细胞的活性耗竭。(c)在肿瘤细胞中,PD-L1的表达或不依赖于肿瘤微环境中的炎症信号,AKT、STAT3信号通路的激活可诱导表达PD-L1,或依赖于炎症信号,表达下游的免疫检查点抑制蛋白。

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目前,肿瘤的联合免疫疗法越来越体现出它的优越性。一方面,要减少肿瘤靶向结合的非特异性,减少治疗过程对正常细胞的杀伤,我们需要尽可能地将免疫系统引起的细胞毒性局限在肿瘤组织中(靶向药物)。另一方面我们需要解除肿瘤细胞和免疫细胞之间的免疫负调控,提高免疫细胞对肿瘤细胞的细胞毒性(免疫负调控抑制),使肿瘤杀伤单抗药物的肿瘤杀伤作用更能发挥威力。

在这些治疗方案中,都以T细胞免疫为核心。虽然细胞毒性T细胞的肿瘤杀伤作用具有一定的特异性,然而极优而劣。因为细胞毒性T细胞的特异性,来源于被杀伤细胞的MHC-I型抗原递呈。只有识别了目标细胞通过MHC-I递呈的抗原,细胞毒性T细胞才能特异性的杀伤靶细胞。然而,狡猾的肿瘤细胞,有相当一部分关闭了其细胞表面MHC-I类分子的表达,比如,92%的宫颈癌细胞,71%的乳腺癌细胞,64%的非小细胞肺癌细胞。这样我们英勇无比的细胞毒性T细胞,对它们就无能为力了。

“如之奈何?”

幸运的是,对付这类狡猾的肿瘤细胞,我们有免疫系统的另一杀手,自然杀伤细胞(Natural Killer Cell, NK细胞)。


02
?我们日益信赖的替补选手: NK细胞


NK细胞,即自然杀伤细胞,是一种具有细胞毒性的淋巴细胞,属于天然免疫系统。NK细胞与获得性免疫系统中的细胞毒性T细胞,扮演着相近的角色。NK细胞对病毒感染的细胞,或者肿瘤形成,有着极快的响应速率。通常情况下,免疫细胞检测到感染细胞表面的MHC,引起细胞因子的释放,进而导致靶细胞裂解或凋亡。但NK细胞有所不同,它们可以在没有抗体或MHC的情况下,识别这些细胞并进行快速的免疫响应。对于那些失去自身标记的MHC-I型的细胞,NK细胞不经过激活就可以进行杀伤。而这些细胞通常是有害的,不能被其他免疫细胞发现并消灭,比如细胞毒性T细胞。(图2)

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图2 NK细胞的“丢失自我”的杀伤机制

NK细胞通过自身表面的激活型和抑制型受体,调节自身的细胞毒性,比如杀伤细胞类免疫球蛋白受体。大部分受体不仅表达在NK细胞上,也表达在T细胞上。抑制型受体识别并结合MHC-I,这样也可以解释NK细胞杀伤那些没有表达MHC-I的细胞。而MHC-I在抗原呈递过程中,激活细胞毒性T细胞。但是,当被感染或变异的细胞,逐渐降低表达MHC-I,使它们自身免于被T细胞发现,规避T细胞免疫。而NK细胞正好弥补了这一点。

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尽管NK细胞并不需要肿瘤相关抗原识别,来调整抗肿瘤的响应,但NK细胞同样存在免疫检查点的激活或抑制机制。虽然目前在细胞因子治疗方法,以及NK细胞过继转移等方面有所进步,但是,肿瘤细胞表达的针对NK细胞免疫检查点的配体,仍然能够抑制NK细胞介导的肿瘤细胞裂解。于是NK细胞功能缺失,肿瘤逃逸,病情加剧。因此目前有一些新的药物被研发出来,针对肿瘤-NK细胞的抑制型免疫检查点,以限制这种抑制作用。

当细胞在病毒感染向肿瘤转化期间,产生了应激压力或DNA损伤,就会产生胚系编码配体(germ-line ligand),这些配体可以被NK细胞表达的胚系编码受体(germ-line receptor)识别。而当细胞出现低表达MHC-I的情况时,就会触发“丢失自我”杀伤机制。因此为了最大程度地减少对正常细胞或组织的杀伤,必须微妙的平衡这种激活或抑制的信号,以调节NK细胞的活性。

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03
?NK细胞表面的激活或抑制型受体


NK细胞表面激活型的受体包括:自然细胞毒性引发受体(NCRs)、SLAM家族受体、c型凝集素、CD16(FcγRIII)。例如CD16并不识别细胞表达的配体,而是识别细胞结合的IgG抗体的Fc部分,而且单独通过CD16就足够引发强大的激活信号且克服大部分抑制信号,引发NK细胞-抗体介导的ADCC。另外,C型凝集素的同二聚体NKG2D,识别细胞表面因DNA损伤或应激压力而上调的分子。这些激活型受体结合配体后,还能引发细胞因子比如IFN-γ、TNF-α的分泌,其中IFN-γ可诱导周围细胞MHC-I的表达,增强CD8+ T细胞的识别能力(图1)。

NK细胞表面抑制型的受体包括:杀伤细胞免疫球蛋白类似受体(KIRs)、c型凝集素受体(NKG2A/CD94)、白细胞免疫球蛋白类似受体(LILRs)、常见的免疫检查点受体(PD-1、TIM-3、LAG-3、TIGIT)。它们当中大部分的配体,是MHC-I,而广泛表达的MHC-I配体介导的抑制信号,对于NK细胞响应调节至关重要。这些抑制型受体的表达,因NK细胞亚群不同而不同,比如CD56bright的NK细胞都表达NKG2A/CD94,而不表达KIRs,但是CD56dim的细胞只有约50~60%表达NKG2A/CD94,70~75%表达KIRs。

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图3 NK细胞与肿瘤细胞间的激活或抑制型受体-配体相互作用

NK细胞的响应被这些激活或抑制型的相互作用的平衡微妙地调节,而这些NK细胞受体的表达取决于NK细胞的亚群,以及肿瘤微环境中的细胞因子或可溶性配体。同时,肿瘤细胞表达对应的配体,也依赖于肿瘤类型和微环境。

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肿瘤细胞分裂期间,一定程度地引起DNA损伤,这会诱导NKG2D和DNAM-1的表达,进而引发NK细胞对肿瘤细胞的杀伤。然而,肿瘤细胞可以通过上调非经典的MHC-I,即HLA-G的表达,结合NK细胞的抑制型受体LIR-1,规避NK细胞的识别和杀伤。同时,肿瘤细胞也可以通过可溶性的NKG2D的配体,规避杀伤。这些配体通过可变剪切的方式,从肿瘤细胞表面脱落。于是NK细胞难以通过激活型受体NKG2D与其配体结合,也就难以激活对肿瘤细胞的杀伤。同时,这些可溶性的NKG2D配体,可以结合远处近处的NK细胞的NKG2D激活型受体,使其处于持续激活状态,而降低了NK细胞识别的敏感性。

一些位于肿瘤微环境中的抑制型免疫细胞,比如骨髓衍生抑制细胞(MDSCs)、调节型T细胞(Treg)可以抑制NK细胞的抗肿瘤活性。MDSCs通过分泌抑制型细胞因子IL-10和TGF-β,其中TGF-β可以下调NK细胞表面NKG2D的表达,或者通过细胞接触的方式,抑制NK细胞的活性。同样的,Treg也可以通过膜表面的TGF-β抑制NK细胞的活性,且Treg也通过竞争性消耗IL-2以减少IL-2对NK细胞的激活。

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04
?“自然杀伤”替补选手的弱点


关于NK细胞的免疫检查点,同样存在着可能的负调控机制(图3展示了一部分):

PD-1,在B细胞和T细胞表面存在诱导性表达,同样的,在NK细胞表面也有表达,尽管表达特性并不清楚,但PD-1减弱免疫功能的机制是明确的。不过,当NK细胞提升对肿瘤细胞的响应时,特别是IFN-γ分泌时,可能会导致肿瘤细胞PD-1配体的上调表达,从而反馈抑制NK细胞的响应。

CTLA-4,在激活的鼠源NK细胞上发现存在表达。但目前几乎没有线索能直接说明,人源NK细胞表达CTLA-4的相关活性。

TIGIT,带有Ig和ITIM(细胞内基于酪氨酸的抑制模体)结构域的T细胞免疫受体,通常在NK细胞上有所表达,属于抑制型受体,与DNAM-1共享PVR和Nectin-2受体。许多肿瘤过表达TIGIT的配体,CD155,这与肿瘤的增殖和迁移有关。在肿瘤环境中,CD8+T细胞和Treg都会上调表达TIGIT,而阻断TIGIT能够增强T细胞的功能。类似的,阻断TIGIT能够增强NK细胞分泌细胞因子和细胞毒性的能力。有数据表明,MDSC通过TIGIT信号通路,抑制NK细胞的活性。

KIR,杀手细胞免疫球类似受体,有抑制型和激活型两种,针对抑制型的KIR的阻断,是免疫治疗的主攻方向。抑制型KIR有两类,表达2个胞外免疫球类似结构域(KIR2DL),或者表达3个免疫球类似结构域(KIR3DL)。两类KIR的信号通路都通过ITIM(细胞内基于酪氨酸的抑制模体)实现。KIR能够识别并结合MHC-I,以抑制NK细胞的活性。在NK细胞的发育和稳态阶段,KIR与自身的MHC-I的相互作用,对于NK细胞“教育”的动态过程非常关键。尽管在肿瘤环境中,NK细胞上调表达激活型受体,但许多肿瘤能够保留它们的MHC-I,从而能够限制KIR表达NK细胞的响应和杀伤能力。而KIR信号通路的阻断型抗体,能够起到一定的肿瘤治疗的效果(图4)。

KIR抗体,IPH2101,在针对那些完全缓解状态的急性髓细胞样白血病患者的I期临床研究中,显示KIR结合发生在90%以上的NK细胞中(2周,最小剂量1mg/kg体重)。KIR抗体的治疗也升高了TNF-α和MIP-1β的血清浓度,以及NK细胞早期的激活标签CD69。在多发性骨髓瘤的治疗中,KIR抗体也产生了类似的效果。然而,在关于郁积性多发性骨髓瘤(MM)的II期临床中,并没有显著疗效。这可能与IPH2101介导的KIR2D受体的胞啃作用有关,即通过KIR抗体的ADCC作用,KIR2D受体被“啃掉”并转移到其他免疫细胞。尽管KIR抗体有效地阻断了KIR2D的信号通路,但是也阻断了这些表达KIR2D的NK细胞被“教育”(结合MHC-I)的能力,最终可能导致NK细胞对MM细胞的响应清零。这个难题也揭示了,在复杂的生物系统中,靶向检查点抑制研发所存在的一些挑战。


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图4 NK细胞相关免疫检查点的抗体,以及它们的临床研究进展(截至2017年)?

C型凝集素异二聚体NKG2A/CD94,在NK细胞和CD8+T细胞上都有表达。它属于抑制型受体,对应的配体是HLA-E,可强烈抑制血液循环中的NK细胞。在很多肿瘤类型比如实体瘤或血癌中,上调编导HLA-E,从而减弱表达NKG2A的NK细胞的响应。在异源和自体造血干细胞移植中,NKG2A广泛表达于新生的NK细胞上,它与HLA-E的相互作用成为移植性治疗后NK细胞活性的主要抑制因素。在这个条件下,NK细胞通过减少NKG2A的表达,恢复NK细胞功能,并最终成熟。但在NK细胞完全成熟之前,阻断NKG2A也可以恢复功能,因此NKG2A的功能抑制型抗体也有希望用于治疗肿瘤。

Tim-3,T细胞免疫球和黏液素结构域包含分子,是T细胞调节免疫响应的负调节因子。小鼠中抗Tim-3的作用,导致自发性的自身免疫作用。在晚期胃癌和肺腺癌患者的外周NK细胞中,Tim-3上调表达。同时,在75%的胃肠道间质瘤患者中,肿瘤滤过性的NK细胞上有表达Tim-3。NK细胞表达的Tim-3的具体功能并不明确。源自晚期黑色素瘤的患者的功能受限的NK细胞,通过Tim-3拮抗剂的治疗,功能可获得恢复。然而,阻断Tim-3和它的配体galectin-9的相互作用,减少了健康NK细胞对急性髓性白血病(AML)的IFN-γ的产生。在对PD-1的阻断有抗性的患者中,Tim-3发生了阻断,同时Tim-3表达被上调,因此Tim-3被认为存在抑制免疫活性的作用。

Lag-3,淋巴细胞激活基因3,表达在CD4+和CD8+T细胞上。因只有小部分NK细胞表达Lag-3,并且NK细胞与MHC-II并不相互作用,因此Lag-3的功能还不是很清楚。

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05
?NK细胞的神助攻:激活型细胞因子


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图5 IL-2/IL-2Rα和IL-15/IL-15Rα的结构示意图

IL-2和IL-15共享受体的两个亚基,即IL-2Rβγ和IL-15Rβγ完全相同,双亚基复合体以中亲和力受体存在,而结合了IL-2Rα或IL-15Rα的三亚基复合体,则以高亲和力受体存在。NK细胞表达中等亲和力的IL-2和IL-15受体。通常情况下,IL-2通过顺式作用,即先于同一细胞的IL-2Rα结合,然后与βγ结合,但NK细胞没有表达IL-2Rα,需要较高浓度的IL-2才能激活。而IL-15通过反式作用,即先于另一细胞(巨噬细胞、DC细胞)的IL-15Rα结合,然后与βγ结合。

NK细胞可以通过两种方式克服抑制,一是激活型细胞因子,比如IL-2、IL-15,二是CD16(FcγRIII)介导的NK细胞激活。IL-2和IL-15共享相同的βγ-受体亚基,而各自的α受体亚基可以提高它们在受体上的亲和力,它们结合对应的高亲和或中亲和受体,激活JAK-STAT信号通路,最终诱导更多的细胞因子的表达,细胞毒性的效应功能,以及增殖和存活。

IL-2治疗已经被大量研究,但是单独使用IL-2所产生的疗效并不显著。IL-2的一项缺点是,尽管它能够激活NK细胞,但同时,它也可以增强Treg的活性,限制NK细胞的响应。高剂量IL-2治疗肾癌或转移性黑色素瘤,只能让小部分患者的病情缓和,并且残留有大量细胞毒性。因为低剂量的IL-2更利于激活Treg的功能,所以IL-2治疗受限,而IL-15对于NK细胞依然有较好的刺激效果,且不会激活Treg的功能。

IL-15被用于实体瘤的治疗,以及在白血病患者中,维持NK细胞数量和活性。临床前、非人类哺乳动物以及早期临床的数据都表明,IL-15可以诱导NK细胞数量上升。其中IL-15与IL-15Rα的反式呈递,对最大化IL-15功效是必要的。ALT-803(IL-15N72D/IL-15Rα-Fc超级激动剂),在最近针对卵巢癌的鼠模型研究中,使NK细胞非常显著地去颗粒化,并导致细胞因子的大量产生。如ALT803能够使卵巢癌患者腹水中的NK细胞恢复活性。同时,在抗CD20抗体的联合作用下,ALT803增强了CD16引发NK细胞对B淋巴细胞的清除。IL-15一方面能够协助越过免疫检查点的抑制机制,另一方面能够完善NK细胞上CD16介导的功能,因此它成为了新的热门免疫治疗靶点。

CD16a,即FcγRIIIa,NK细胞表达的Fc低亲和受体,介导抗体的直接杀伤ADCC。CD16a表达在CD56dim的NK细胞上,这些NK细胞在健康个体内,占有至少80%的所有外周的NK细胞。CD16a与Fc结合后,通过ITAM信号通路,导致细胞因子的产生和细胞的去颗粒化。与NK细胞的其他激活型受体不同,CD16a与Fc的结合不需要协同激活,就可以产生强力的响应,这也使得NK细胞能够在病毒感染和肿瘤形成早期,通过抗体产生免疫反应。然而,NK细胞表达的CD16a对不同抗体的Fc亲和力有所差异,介导的ADCC的效果参差不齐。因此,开发BiKE和TriKE之类的分子,能改进亲和力,并且可以针对不同的肿瘤相关抗原。


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图6 BiTE和BiKE

BiTE能够同时结合T细胞和肿瘤细胞,具有两条scFv串联结构的抗体,分别结合T细胞的CD3ε(TCR亚基)和肿瘤细胞的肿瘤相关抗原。而BiKE则能够同时结合NK细胞和肿瘤细胞,结构与BiTE相近,结合NK细胞的CD16a,强化ADCC作用,以及肿瘤相关抗原。新一代的BiTE甚至加入了抗PD-1/PD-L1的scFv,以减少免疫检查点抑制。类似的原理(图3),BiKE可以融合IL-15或拮抗前述受体信号通路的scFv(TriKE),移除免疫抑制或增强免疫响应。

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06
?脑洞大开的NK细胞肿瘤免疫治疗

激活NK细胞、解除NK细胞的免疫抑制、限制NK细胞毒性的时空。

新的针对NK细胞的研究,比如仿照BiTE思路而来的BiKE(图6),以及仿照CAR-T思路的CAR-NK(另文描述)。BiTE加上抗PD-1的部分成为了CiTE(检查点抑制T细胞连接抗体),那么BiKE加上了IL-15的部分而成为了TriKE(三功能NK细胞连接抗体,图7,8):


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图7 CiTE和TriKE

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图8 TriKE的临床研究正在招募中

如果说,TriKE给我们提供了增强NK细胞的免疫响应和特异性的参考,那么如何武装NK细胞,是可以关注的点。一方面,抑制NK细胞的抑制性信号通路,比如抗体阻断NK细胞表面的抑制型受体,或者激活NK细胞,通过结合激活型受体的配体,比如IL-2、IL-15、Fc等;另一方面,提高NK细胞,尤其是渗透到肿瘤组织的NK细胞的有效性,提高针对肿瘤细胞的特异性,比如利用抗肿瘤的单抗。那又如何将这几方面的优势综合起来“武装”NK细胞?

细胞因子对肿瘤的治疗效果,因为受到药物传递的限制,无法在肿瘤病灶部位产生足够的活性,比如之前提到过IL-2的局限性。为了最大化细胞因子的治疗效果,重组的抗体-细胞因子融合蛋白被广泛研究,以增强单抗靶向肿瘤的能力。如此,细胞因子通过单抗,被引导至特异性的肿瘤部位,能够刺激引发更多有效的抗肿瘤响应,并且避免单独使用细胞因子时会造成的系统性的细胞毒性。


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图9 用于免疫治疗的细胞因子,其中一些还处于临床研究阶段

细胞因子是多肽或蛋白质,在重组基因表达上,容易实现在哺乳动物细胞中的表达,只需将INFs、ILs之类的融合在抗体的N端或C端。比如罗氏在研的RG7813(图10),包含抗CEA单抗,且其中一条重链的C端融合改造后的IL-2。同样的,前文提到的TriKE,基于scFv抗体,以拉近NK细胞和肿瘤细胞,并通过融合细胞因子激活NK细胞的活性。


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图10 RG7813示意图

抗CEA单抗特异性结合CEA最靠近细胞膜表面的结构域,而不结合因酶切作用而进入血液的可溶性部分,sCEA属于肿瘤细胞抑制体液免疫的作用。IL-2通过突变改造,偏向于结合IL-2中等亲和力受体IL-2Rβγ,从而激活NK细胞或CD8+细胞毒性T细胞。因为IL-2存在,Fc的ADCC/CDC的活性被取消,为了长效作用仍保持FcRn的结合,并且因为单侧结合IL-2,引入KiH技术实现Fc的异二聚化。

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设计理想中的抗体-细胞因子融合蛋白,包括以下步骤:

选择合适的靶向抗原:在正常组织中表达量极低的肿瘤相关抗原,以减少抗体“沉没”在正常组织中而无法发挥药效,同时也需要肿瘤组织中尽可能高表达,以便富集足够多的细胞因子。细胞表面的抗原,结合后不会被细胞吸收,这样可以延长融合细胞因子的半衰期。肿瘤微环境相关抗原也可以,比如与肿瘤迁移、浸润相关的细胞因子。在血液循环中没有显著的数量,比如sCEA,能够持续性消耗激活的免疫细胞,使这些免疫细胞无法造成有效杀伤。

选择合适的细胞因子:考虑细胞因子靶向到肿瘤细胞的目的,还没有一种单一的细胞因子具有所有的抗肿瘤的特性。是为了激活和辅助增殖T细胞、NK细胞还是巨噬细胞?是否需要直接作用于肿瘤细胞,还是用于抑制肿瘤组织血管的形成?细胞因子介导的杀伤机制,诱导T细胞的细胞毒性,还是ADCC,还是直接作用?本文优先考虑对NK细胞的激活作用。

结构的选择:完整的抗体结构,scFv,Fab等等。

融合细胞因子的生物活性:通过定量比较,维持完全的亲和力和生物活性,或者减弱活性以减少脱靶造成的系统性细胞毒性。正常组织中,过高的亲和力可能导致细胞毒性。而结合到靶细胞后,也要注意抗体介导的巨噬细胞吞噬,除非细胞因子靶向作用于巨噬细胞。这会使融合的细胞因子被巨噬细胞吞噬和消除。因此,如果用到了Fc融合,Fc往往需要通过改造以减少细胞因子的非特异消耗。

PK和PD:足够长的半衰期,以便于在肿瘤部位富集。

临床前药效估计:在肿瘤模型动物实验中,检测抗肿瘤药效和免疫毒性。

剂量和使用规划:在肿瘤微环境以及宿主的免疫效应细胞的条件下,基于耐受性和药代的效果制定。


抗体细胞因子的融合,要求它针对肿瘤细胞的活性和有效性,强于单独用抗体或单独用细胞因子的效果,否则联合用药可以达成更好的效果。因此,最好在相关同基因的免疫活性动物模型中,验证融合蛋白的效果。

最后,以TriKE的构建理念为结尾,一方面靶向肿瘤细胞,一方面靶向NK细胞,激活NK细胞或者解除NK细胞的免疫抑制,然后通过IL-2或IL-15的改造体激活NK细胞的活性。如果融合的细胞因子,在TriKE功能的基础上,活性可限制在肿瘤微环境中释放,而且本身在血液循环中有较长的半衰期,这可能比TriKE更为理想。





撰文:道尔生物 陆欢

来源:药渡



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